摘要：目的根据历代本草记载的辅料种类，对比不同辅料炮制何首乌的减*效果差异，为优选何首乌炮制减*的辅料提供参考。方法采用UPLC-Q/TOF-MS表征不同辅料炮制何首乌样品的化学信息，以培养的正常人肝L02细胞为对象评价肝细胞*性，综合比较不同辅料炮制何首乌的减*效果差异及成分变化规律。结果不同辅料对何首乌炮制后的化学指纹图谱、指标性成分及肝细胞*性有不同程度的影响，在相同蒸制压力和时间条件下，黑豆、米泔水或大枣蒸制对何首乌的主要成分包括没食子酸、儿茶素、顺式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷、大*素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大*素甲醚和大*素及肝细胞*性的影响相对较大，减*效果最好的3种辅料分别为米泔水＞大枣＞黑豆。通过简单相关和多元相关综合分析，提示顺式二苯乙烯苷可能是何首乌肝细胞*性相关的主要化学成分，大*素-8-O-β-D-葡萄糖苷可能是何首乌潜在的*性相关成分。结论传统记载的不同辅料用于何首乌炮制均可减*，目前除了常用的黑豆有较好的减*效果外，米泔水或大枣也可作为何首乌炮制减*的候选辅料。
何首乌PolygoniMultifloriRadix为蓼科何首乌属植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块根，传统认为其炮制品为无*中药[1-3]。然而，近年来国内外有关何首乌及其制剂引起肝损伤不良反应频见报道[4-5]。国家药品监督管理局先后通报了何首乌及部分制剂致肝损伤的风险。古代本草一般不认为制何首乌有*，但亦认识到其偏性，认为通过炮制可减弱其偏性；而现代研究证实炮制可显著降低何首乌的肝*性风险[6-7]。历代医籍和本草记载了多种何首乌炮制方法，涉及多种炮制辅料[8]。目前《中国药典》年版收载何首乌的炮制方法采用黑豆作为辅料[1]。除此之外，传统炮制方法还有女贞子炮制、米泔水炮制、黑豆酒蒸法、白酒炮制、*酒炮制、牛乳拌蒸法等20余种[8-16]。何首乌添加不同辅料炮制减*过程中，化学成分可能发生不同的变化[17]，不同辅料对何首乌减*效果的影响尚缺少系统的比较和研究。为此本研究选取历代医籍记载的不同辅料，系统比较辅料种类对何首乌炮制减*效果的影响规律，为优化建立何首乌安全炮制方法提供参考。
1仪器与材料
AgilentTechnologyInfinityUPLC超高效液相色谱仪，AgilentTechnologyiFunnelLC-Q-TOF/MS四级杆串联飞行时间质谱，GA二极管阵列检测器；ZK-82B型真空干燥箱，上海市实验仪器总厂；W12PCSE电压力锅，美的集团股份有限公司；Hei-VAPCoreMLG3旋转蒸发仪，德国Heidolph公司；TC10TM自动细胞计数器，美国Bio-Rad公司；GG-NAPCO恒温二氧化碳培养箱，法国NAPCO公司；AXTD5A台式低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；SW-CJ-2D超净工作台，苏州净化设备有限公司；SNC高压蒸汽灭菌器，重庆雅马拓科技有限公司。
生首乌（批号）、黑豆（批号）、女贞子（批号）及甘草（批号）均购自北京绿野药业有限公司；大枣（批号），北京本草方源药业有限公司；医院第五医学中心肖小河研究员鉴定均为生首乌为蓼科何首乌属植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块根、黑豆为豆科大豆属植物大豆Glycinemax(L.)Merr.干燥成熟种子、女贞子为木犀科女贞属植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实、甘草为豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎、大枣为鼠李科枣属植物枣ZiziphusjujubeMill.的干燥成熟果实。白酒，牛栏山二锅头，北京顺鑫农业股份有限公司；*酒，绍兴*酒，绍兴县唐宋酒业有限公司；牛乳，三元鲜牛奶；大米，购自物美超市，产地湖北；DMEM培养基（批号）、胎牛血清（批号985）、0.25%胰酶（批号）、青链霉素（批号ZC）均购于美国Gibco公司；人正常肝细胞系L02细胞株购自中国典型培养物保藏中心；CellCountingKit-8（CCK-8，批号GD）购自日本同仁化学研究所；PBS（批号）购于北京索莱宝科技有限公司；对照品对乙酰氨基酚（批号-，质量分数≥98.59%）购自中国食品药品检定研究院；顺式2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（简称顺式二苯乙烯苷，批号）、反式2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（简称反式二苯乙烯苷，批号）、大*素（批号）、大*素甲醚（批号）、大*素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号）、儿茶素（批号）、没食子酸（批号）均购自成都普菲德生物技术有限公司，质量分数均≥98%；乙腈、甲醇，色谱纯，Sigma公司；无水乙醇，分析纯，北京市化工厂；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；超纯水，MilliporeMilli-Qwaterpurificationsystem制备。
2方法
2.1何首乌不同辅料炮制品的制备
2.1.1黑豆汁制法取黑豆1.0kg，加水适量，煮约4h，熬汁约1.5kg，豆渣再加水煮约3h，熬汁约1.0kg，合并得黑豆汁约2.5kg[1]。
2.1.2米泔水制法大米0.5kg加入mL水，淘洗30min，取上层液体，即为米泔水[9]。
2.1.3甘草煮制取甘草2kg，加水适量，煮约2h，滤过得煎液3kg，药渣再加水煮2h，滤过，得煎液2kg，合并煎液约5kg。将净药材与煎液拌匀（何首乌片-甘草10∶1）[13]。
2.1.4大枣制锅内铺何首乌一层，大枣一层，重重铺尽[10-11]。
将所购何首乌饮片置带盖不锈钢桶中加入不同辅料（表1），按80%液体量的比例闷润8h至透心，分别置于不锈钢容器中，采用课题组前期优化的何首乌炮制方法，高压（℃，压力0.1MPa）蒸制6h后，置于45℃烘箱中烘干备用[9]。
2.2基于LC-Q/TOF-MS技术的何首乌化学指纹图谱的建立
2.2.1色谱条件色谱柱为AgilentSB-C18柱（mm×2.1mm，1.8μm）；流动相为水-乙腈，线性梯度洗脱：0～5min，5%～32%乙腈；5～6min，32%～55%乙腈；6～12min，55%～88%乙腈；12～15min，88%～90%乙腈；柱温30℃；体积流量0.3mL/min；检测波长nm；洗脱时间15min；进样量0.5μL。理论塔板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于。
2.2.2质谱条件离子源ESI；毛细管电压及锥孔电压分别为V和45V；m/z50～0；脱溶剂气温度℃；脱溶剂气流量11L/min；雾化器压力.kPa（45psi）；鞘气温度℃；鞘气体积流量12L/min；喷嘴电压V。
2.2.3对照品溶液制备分别精密称取顺式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷、大*素、大*素甲醚、大*素-8-O-β-D-葡萄糖苷、儿茶素、没食子酸适量于10mL量瓶中，加入50%甲醇，超声溶解，放冷，补加50%甲醇溶剂至刻度，摇匀，0.22μm滤膜滤过，配制成质量浓度分别为顺式二苯乙烯苷50.9μg/mL、反式二苯乙烯苷51.3μg/mL、大*素49.2μg/mL、大*素甲醚53.1μg/mL、大*素-8-O-β-D-葡萄糖苷48.8μg/mL、儿茶素50.0μg/mL、没食子酸50.1μg/mL的混合对照品溶液，其色谱指纹图谱见图1。
2.2.4供试品溶液制备课题组前期研究表明50%乙醇冷浸提取何首乌供试品的肝细胞*性较强[18]，因此本实验采取50%乙醇制备样品。取何首乌粗粉（过40目筛）适量，精密称定，加入10倍量50%乙醇，超声提取30min，滤过取滤液，减压蒸馏，真空干燥得何首乌干浸膏，计算得率。精密称取适量的何首乌样品醇提物干浸膏，置于10mL量瓶中，加50%乙醇，超声溶解，放冷，补加溶剂至刻度，摇匀，0.22μm滤膜滤过，配制成4mg/mL（以生药量计）的供试品溶液。其中正离子模式下生首乌供试品溶液的总离子流图见图2。
2.2.5方法学考察取同一批何首乌的供试品（S1），按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，分别进行精密度试验、重复性试验、稳定性试验，计算各色谱峰的相对峰面积与相对保留时间。结果显示各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明方法进样精密度及重复性良好，且供试品溶液在24h内稳定，符合指纹图谱测定要求。
2.3何首乌肝细胞*性评价
取适量生首乌和不同辅料炮制的制何首乌饮片，分别加8倍量50%乙醇，置阴凉处密封，冷浸提取。共提取2次，每次48h，合并提取液，浓缩至相应质量浓度备用。将人正常肝细胞系L02细胞以3.5×/mL接种于96孔细胞培养板中，每孔μL，在常规条件下培养24h后，吸弃上清，将何首乌醇提物分别以生药量40mg/mL给药，对乙酰氨基酚溶液按1.7mg/mL给药，每孔μL，重复6孔。药物孵育24h后，吸弃上清，每孔加入10%CCK-8溶液μL。培养箱内反应30min后，nm处检测吸光度（A）值[19]。以仅加入对乙酰氨基酚对照品溶液为对照组（s），不同何首乌醇提物样品溶液为供试品组（t），分别测定对照品、供试品及空白对照（50%乙醇，ctr）吸光度（As、At、Actr），计算不同辅料炮制何首乌醇提物的细胞抑制率，计算公式为细胞抑制率＝1－(At－Actr)/(As－Actr)。
3结果
3.1何首乌生品及不同辅料炮制品指纹图谱表征及成分含量变化
采用“2.1”项下方法制备样品和“2.2”项下液相、质谱条件表征何首乌生品及不同辅料炮制品化学指纹图谱，运用《中药指纹图谱相似度评价系统版》软件，以S1样品指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度设为0.1min，经多点校正后进行色谱峰匹配和叠加，所得何首乌生品与不同辅料炮制品的相似度差异并不大（表2），但就生成的各炮制品指纹图谱的匹配状况可以看出各共有峰还是存在一定差异（图3）。因此，本实验进一步通过提取相应供试品的离子流色谱图信息、对照品各成分色谱峰信息及参考相关文献报道[20-21]，标定7个共有指纹峰，分别为顺式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷、大*素、大*素甲醚、大*素-8-O-β-D-葡萄糖苷、儿茶素、没食子酸。
为获取更详细的化学成分变化信息，本实验提取何首乌生品及不同辅料炮品醇提物对应色谱峰峰面积进行主成分分析（principal